siRNA 纳米递送系统研究进展

作者:文博论文查重     发表时间:2021-09-27 20:40:12   浏览次数:26


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  摘要小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)是RNA干扰的引发物,激发与之互补的目标mRNA沉默,对基因调控及疾病治疗有重要意义.siRNA作为药物需要克服血管屏障、实现细胞内吞及溶酶体逃逸,同时还需要避免核酸酶作用下发生降解.因此,设计合适的纳米载体以帮助siRNA成功递送进细胞并发挥作用是目前siRNA药物发展的重要目标.纳米载体的材料种类、尺寸、结构、表面修饰等精确设计是实现siRNA药物成功递送的重要因素.随着研究的深入和应用的发展,siRNA药物纳米载体的精确控制制备、精准靶向递送及多功能化取得了较好的成果.本文围绕siRNA药物纳米载体,对siRNA药物应用及其递送困难、siRNA药物纳米载体主要设计策略、目前siRNA药物上市情况进行介绍,同时对其未来发展方向进行展望.

  关键词RNA干扰,siRNA药物,纳米载体,纳米药物递送

  小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),也被称为沉默RNA、短干扰RNA、非编码RNA.siRNA是生物针对外源侵入基因所表达的双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)进行切割后生成的具有特定长度和序列的小片段RNA,siRNA的特定长度为21~25bp[1].这些siRNA可以通过RNA干扰作用特异性沉默耐药相关基因的表达来改善化疗药物的抗癌效果.RNA干扰于1998年首次在哺乳动物细胞中被发现,Fire等人向秀丽隐杆细虫(Caenorhabditiselegans,C.elegans)中递送长片段的dsRNA,结果显示dsRNA能有效沉默目标基因表达[2].此后,逐渐发现RNA干扰是由双链RNA诱导同源mRNA高效特异性降解的现象.这种诱导基因沉默的机制是通过阻碍特定基因的翻译从而抑制特定基因的表达,是真核生物细胞的一种重要防御机制[3].2001年,Elbashir等人将干扰RNA应用于人类疾病的治疗,用实验证明了合成的siRNA可以限制一个基因在哺乳动物的不同细胞系中特异性排列的方式[4].2004年,第一个以siRNA为基础的RNA药物(治疗湿性年龄相关性黄斑变性)进入I期临床试验[5-6].2010年,第一次应用于肿瘤患者的有针对性的纳米颗粒输送系统进入I期临床试验,siRNA开始系统性地应用于实体瘤[7].从此siRNA的研究进入全新的领域,开始了快速发展的阶段.

  1RNA干扰

  1.1RNA干扰作用机制

  RNA干扰是一种RNA分子作用的过程,它通过与目的基因序列的编码互补,从而诱导降解相对应的信使核糖核酸(messengerRNA,mRNA),阻止mRNA翻译成蛋白质[8-9].RNA干扰通过传递小RNA发挥作用,包括siRNA、微小RNA(microRNA,miRNA),短发卡RNA(smallhairpinRNA,shRNA)和内切酶底物RNA(dicersiRNA,dsiRNA)等形式[10].其中,shRNA的作用途径在最上游,若使其发挥效用,需要细胞核加工;其次是dsiRNA,若使其发挥效用,需要内切酶处理[11].而siRNA和miRNA是目前研究的核心,其作用途径是直接输送到RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),二者不同之处是miRNA并不需要完全与目标序列配对,而siRNA则需要完全与目标序列配对,这种差异就导致miRNA和siRNA发挥不同的基因沉默效果;同时miRNA抑制翻译,而siRNA诱导Argonaute-2蛋白降解.哺乳动物细胞中miRNA与siRNA介导的RNAi机制图1所示[12].(1)哺乳动物初级miRNA转录本(pri-miRNA)在细胞核中转录(2)并被微处理器复合体(Drosha–DGCR8)切割以产生(~30bp)shRNAs,称为pre-miRNA.(3)输出蛋白5(Exportin5)结合并运输pre-miRNA到细胞质,(4)在细胞质中它与Exportin5脱离(5)并与Dicer和TARRNA结合蛋白(TARRNA-bindingprotein,TRBP)结合.(也有非Dicer介导的途径.)(6)Dicer切割pre-miRNA的末端环(7)并诱导形成RISC装载复合物(RISC-loadingcomplex,RLC),与Argonaute(Ago1–Ago4)蛋白质结合.(8)选择反义链并将其装载到Ago1-Ago4中,并丢弃正义链.(9)成熟的RISC可以通过抑制mRNA翻译、诱导mRNA在细胞质P-体和/或GW-体中的螯合、促进mRNA降解和指导靶基因位点的转录基因沉默来调节基因表达.Argonaute、GW182和反义链对于RISC的mRNA沉默活性至关重要.TRBP和Dicer可以在反义链装载后与成熟的RISC分离.与反义链的种子区域(从5ʹ端开始的第2-8个碱基)互补的mRNA即可受到RNAi的影响.(10)合成的siRNA通过胞吞作用进入细胞质,随后发生内涵体逃逸.(11)siRNA随后直接与胞质RNAi酶(Dicer和TRBP)相互作用,(12)通过Dicer介导或非Dicer介导的途径形成RLC(13)并进行链选择以产生成熟的RISC.(14)siRNA反义链通常与单个靶标mRNA具有完全互补性,以诱导有效且靶向范围窄的基因沉默.(15)Ago2对于RNAi疗法尤其重要,因为它具有内在的剪切活性,可以有效地切割mRNA靶标.图中m7G为7-甲基鸟苷.

  1.2RNA干扰的应用

  由于RNA干扰的有效性和选择性,它已成为沉默哺乳动物细胞中特定基因表达的首选方法.通过RNA干扰特异性沉默治疗,在病毒感染、癌症、家族遗传病和自身免疫病等方面有着广泛的应用[13].由一个或几个基因的异常表达引起的各种人类疾病都适合使用基于RNA干扰干预的治疗策略,包括显性遗传疾病、病毒感染、癌症和自身免疫疾病等[14].首要的RNA干扰治疗应用是针对遗传疾病的治疗,如突变等位基因转录物中的单核苷酸多态性可用作RNA干扰的选择性靶标.Miller等人在实验中使用siRNA作为RNA干扰研究核心,siRNA仅直接选择性地降解突变转录物,尽管突变型与野生型序列只有一个错配,但实验中野生型转录本仍可保持完整[15].RNA干扰也可用于抑制病毒感染.McCaffrey等人首次利用体内RNA干扰治疗乙肝,实验中使用高压尾静脉注射共递送乙型肝炎复制子和编码抗乙肝病毒(HBV)的shRNA,利用其polIII表达体系来治疗乙肝,可以实现肝细胞中99%的HBV核心抗原的敲除[16].除了上述应用之外,将RNA干扰用于癌症治疗具有非常广阔的前景,可以彻底改变这种破坏性疾病的治疗方法.

  在肿瘤的发生和后续发展过程中涉及到多种基因的非正常表达和功能异常化.而造成这些基因功能异常化有两个原因:一是由于正常基因的过度表达造成的;二是由于正常基因发生突变而产生的功能异常的等位基因,因此肿瘤在一定程度上也可被称为基因疾病.近年来随着对肿瘤致病机制的深入研究,以肿瘤细胞内信号转导通路的关键激酶为药物筛选靶点成为抗肿瘤药物研究的新途径,通过这种途径可以获得高效、低毒及高特异性的新型靶向药物.目前,正处于研究或临床应用的新型靶向药物一般都属于疾病基因或靶基因的抑制剂,其通过在肿瘤细胞中沉默相关高表达的疾病基因或靶基因,从而有效地抑制肿瘤生长.而RNA干扰能够简单高效地沉默靶基因的表达,因此利用RNA干扰可以起到与靶向药物相同的作用.而且,靶向抑制剂主要直接作用于蛋白,但是通过这种方式可能会干扰其他蛋白的表达;而siRNA则主要作用于mRNA,其能够特异性抑制靶基因的表达,作用位点专一,通常不影响正常基因表达,因此siRNA作为靶向药物应用时,会具有更好的选择性及特异性.理论上,通过siRNA几乎能够抑制体内任何基因的表达,使得siRNA比现在广泛应用的小分子靶向药物更具有治疗和应用潜力[17].

  1.3siRNA药物的优势

  siRNA药物由于其不同于其他药物的独特性质,相较于其他药物,在某些疾病治疗上展现出巨大优势(图2),主要表现在以下方面:

  第一,siRNA可以通过序列设计靶向不同的靶基因[18],从而实现对不同疾病的治疗;同时这种设计是快速的,并且具有高效的沉默效果.除此之外,siRNA的合成不需要细胞表达系统,不用像蛋白质药物需要经过表达、纯化等繁琐的步骤;

  第二,siRNA的沉默效果是瞬时的,并不会敲除靶蛋白的表达基因[19].因此,如果作为研究对象的目的基因是生存所必需的,或是想研究随时间推移靶蛋白表达降低的影响,siRNA是非常合适的工具;

  第三,siRNA的靶点特异性强.对于同一个家族的激酶而言,小分子抑制剂常会出现脱靶效应而产生副作用,而使用siRNA作为药物可以通过序列的精确设计尽可能减少脱靶的产生;

  最后,siRNA的效果容易被检测.siRNA的作用机理简单,通过直接降解靶基因的mRNA,达到降低靶基因表达的效果.故检测降低效果时,可以通过qRT-PCR检测mRNA的含量;也可以通过WesternBlot等方法直接检测蛋白水平的表达量.而小分子抑制剂通常是通过结合蛋白的特定位点,影响蛋白的活性,但是靶基因本身的mRNA和蛋白量并没有发生变化,需要尝试其他方法才能检测小分子的效果.

  正是由于siRNA药物表现出的一系列优势,近年来,siRNA药物越来越受到重视,与其有关的研究也越来越多.

  2siRNA纳米递送系统与上市药物

  2.1siRNA纳米递送系统

  siRNA是一种很有前景的治疗解决方案,通过转录后基因调控解决基因过表达或突变引起的多种病理状况,如病毒感染、癌症、遗传疾病和自身免疫性疾病(如关节炎)[20].由于其特异性、适应性和广泛的靶向能力,它在多种疾病的个性化基因治疗中也很有效.然而,裸siRNA在血流中不稳定,除了具有免疫原性外,还不能有效地穿过细胞膜.因此,精确设计递送系统对于充分发挥这种疗法的潜力至关重要.

  药物递送系统是用于靶向递送和/或控制释放治疗剂的工程技术.目前,将纳米载体递送技术与RNA干扰技术结合,已经成为一种新型基因药物递送系统,这种体系能够有效递送siRNA进入人体.纳米级尺寸的粒子可通过增强的渗透与滞留效应,从而聚集在肿瘤细胞周围.纳米粒子的尺寸、形状、表面性质、刚性都会影响药物对癌症治疗的效率.纳米载体通常以纳米粒、纳米胶束、纳米水凝胶和高聚物作为药物或基因的载体,同时可在表面键合靶向性分子,如抗体、核酸适体、靶向肽或叶酸等,通过与细胞表面相互作用进入靶细胞.目前纳米载体用来包载的基因主要包括:DNA、RNA(siRNA)、反义寡核苷酸药物(antisenseoligodeoxynucleotides,AODNs)和microRNA等[21-22].

  2.2siRNA纳米药物

  自从2006年RNA干扰获得诺贝尔奖后,过去的十几年中,大型制药公司已经投入了数十亿美元用于人类基因沉默治疗的开发.对于药物开发人员而言,siRNA疗法的潜力是不容忽视的.siRNA具有很强的药效,功能多样,能够对传统小分子药物―无成药性‖的蛋白质编码基因进行抑制,并且具有制备―可编程‖药物的潜力,可以在不改变体内药代动力学的情况下实现重新靶向[12].siRNA疗法的治疗潜力是深远的,许多基于siRNA的药物正在开发中,用于治疗从病毒感染、心血管疾病到遗传性疾病与癌症的各类病症[23-25].利用siRNA的这些独特特性,一些siRNA递送系统最近已进入临床试验阶段(表1),并作为一种非常有效和有前景的癌症治疗方法而被研究者广泛研究.药物开发过程极其艰巨,旨在克服复杂的生理障碍,有效、安全地将siRNA递送到所需的组织和细胞,以及增强siRNA的稳定性与特异性,降低其潜在脱靶效应[26].

  2018年8月标志着RNA干扰治疗的新纪元,美国食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批准了首个基于RNA干扰的药物Onpattro(Patisiran)[12],由美国Alnylam制药公司(AlnylamPharmaceuticals)研发(表2).Patisiran的批准为医疗需求未得到满足的遗传性运甲状腺素蛋白淀粉样变性(hereditarytransthyretin-mediatedamyloidosis,hATTR)患者带来了新希望,并预示了RNA干扰治疗领域的新时代.2019年11月20日,Alnylam公司的第二种RNA干扰药物Givlaari(Givosiran)获得FDA批准[27-28].一年后的11月23日,该公司的第三种药物Oxlumo(Lumasiran)获得批准[29].如今,针对肝脏,肾脏和眼部适应症的多种候选药物正在I、II和III期临床试验中,并且针对中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)和其他非肝组织的研究性新药(investigationalnewdrug,IND)应用有望在未来两年实现.在接下来的10年中,随着RNA干扰途径新功能的发现、具有增强的特异性和药效的先进RNA干扰负载策略的开发,以及全身和局部RNA干扰递送方法的持续创新,RNA干扰领域新的突破性疗法将会不断涌现.

  Patisiran是这三种上市药物中较典型的siRNA纳米递送系统.2018年8月10日,FDA批准了作用于肝脏的siRNA药物Patisiran(Onpattro;Alnylam制药)[12].Patisiran(也称为ALN-TTR02)是用于治疗运甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)淀粉样变性的siRNA脂质纳米颗粒(lipidnanoparticle,LNP).hATTR是一种罕见的、遗传性的、威胁生命的神经退行性疾病,由TTR淀粉样蛋白沉积在周围神经系统、心脏、胃肠道和其他器官中导致.患者患有进行性神经病、心肌病、行动障碍和其他各种衰弱的症状,诊断后中位生存期为5至15年.

  大多数TTR蛋白在肝脏中产生.TTR中有超过120个突变可引起hATTR.在开发Patisiran之前,药物治疗的选择仅限于将TTR四聚体稳定在其天然构象的小分子药物.尽管这些方法可以减慢疾病的进展,但是仍然迫切需要更有效的治疗选择.

  PatisiransiRNA(ALN-18328)通过沉默肝细胞中的野生型和突变型TTRmRNA来降低TTR蛋白的血清水平.为了对TTRmRNA变体实现广泛的沉默活性,反义链靶向mRNA的3′非翻译区,这段序列据推测在患者人群中变异性较小.与临床开发中的大多数siRNA不同,ALN-18328并非经过完全修饰、代谢稳定的siRNA,并且没有靶向配体来增强肝细胞的摄取,而是通过将ALN-18328封装在用于肝细胞摄取的固体脂质纳米粒(LNP)中来实现递送(图3).Patisiran由与脂质赋形剂复合的siRNA组成.这些成分在酸性pH值下组装成LNP,并每3周(q3w)静脉注射一次,剂量为0.3mg/kg,siRNA靶向TTR基因的3ʹ非翻译区(untranslatedregion,UTR),该基因编码运甲状腺素蛋白,以沉默所有可能存在编码区突变的mRNA.RNAi沉默导致循环TTR蛋白含量持续减少>70%,有效阻止TTR淀粉样蛋白的沉积.对于图中的siRNA,'m'=2ʹ-O-甲基修饰碱基,'r'=RNA,'d'=DNA.

  在临床上测试了两代LNP制剂:ALN-TTR01和ALN-TTR02.ALN-TTR02(现在称为Patisiran)是一种―第二代‖聚乙二醇化LNP,包含胆固醇、极性脂质(distearoylphosphatidylcholine,DSPC)、聚乙二醇脂质(PEG2000-C-DMG)和可电离的氨基脂质(DLin-MC3-DMA),在pH值为7时呈中性,但在酸性pH值下(最佳pKa为6.44)变为阳离子.siRNA-LNPs通过在酸性pH下(当DLin-MC3-DMA为阳离子时)siRNA和脂质赋形剂之间的静电相互作用组装.组装后,LNP表面上的PEG2000脂质在储存过程中保持颗粒稳定性.在全身循环中,PEG2000-C-DMG丢失并被血清蛋白,尤其是载脂蛋白E(apolipoproteinE,ApoE)取代,后者与掺入LNP脂质基质的胆固醇分子相互作用.在肝脏中,肝细胞吸收被ApoE覆盖的LNPs,然后将其发送至内涵体,在内涵体的酸性pH下引起氨基脂质成分的再离子化,从而导致颗粒分解.解体的脂质小球(借助DLin-MC3-DMA展开的脂质尾部构型帮助)与内涵体膜之间发生静电和疏水相互作用,从而帮助siRNA逃逸到细胞质中.与使用较早的可离子化脂质(DLin-DMA)的ALN-TTR01相比,Patisiran在体内的效力提高了十倍以上.

  Patisiran的III期、双盲、安慰剂对照临床试验(APOLLO)于2013年12月开始招募,共招募了225例hATTR多发性神经病患者.在研究过程中,一些患者接受了Patisiran,并将其结果与接受安慰剂的患者进行了比较.18个月后,接受Patisiran治疗的患者TTR蛋白平均降低了84%.从研究开始到第18个月,与服用安慰剂的患者相比,接受Patisiran的患者的神经功能和生活质量显著改善.在接受Patisiran治疗的患者中:超过一半(56%)的人从研究开始就表现出神经功能的改善,而接受安慰剂的人中仅有4%;超过一半(51%)的人从研究开始就表明生活质量得到了改善,而接受安慰剂的人中仅有10%;对于神经功能未改善的患者,与接受安慰剂的患者相比,神经病变的进展得到减缓.

  2.3siRNA药物临床开发中的困难

  siRNA药物临床开发的进步,促进了siRNA药物开发过程的日益成熟.但其中遇到的许多挫折,也使药物开发过程更加复杂.从中吸取的主要经验教训包括,使用正确的动物模型来预测药物安全性和药物活性;使赋形剂具有尽可能低的复杂性和毒性,以简化其制造、储存和临床测试过程;降低发生重大不良反应的风险[12].使用正确的体外和体内模型准确预测药物毒性和效力至关重要.不同的模式生物对寡核苷酸和赋形剂可能有不同的反应.RNAi药物的一个特殊问题是,它们的毒性和活性在很大程度上取决于动物模型转录组中存在或缺失的序列.在小鼠中不会引起脱靶效应的siRNA很可能在人类中具有无法忍受的脱靶RNAi活性.相反,在沉默小鼠基因方面效果良好的siRNA可能对人类基因几乎没有活性.

  除此之外,需要考虑的重要因素是赋形剂(如纳米颗粒、聚合物、肽和蛋白质)的复杂性、均一性、稳定性、递送效率和毒性.脂质体和聚合物纳米颗粒已被广泛用于提高siRNA的稳定性并改善药代动力学特性,但它们仍然面临一些生理屏障而导致递送效率降低,同时其规模化制造具有很大挑战性,并且所得产品通常在颗粒组成、颗粒特性和载药量方面具有一定程度的异质性,从而更难以在临床开发过程中建立治疗窗口.此外,颗粒在储存或给药后会变得不稳定,并释放分解产物,从而导致难以追踪的毒性.同样,尽管内涵体溶解赋形剂,如蜂毒肽,可以显著改善RNAi试剂的内涵体逃逸,但它们也可能具有潜在的毒性.2016年,Arrowhead报告说,他们的EX1赋形剂是一种修饰以聚乙二醇的GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)偶联的蜂毒肽样内涵体溶解肽,但是在安全性研究中,以高剂量给药时导致了几种非人类灵长类动物的死亡.尽管试验动物死亡的确切原因尚未披露,但使用EX1的三种药物——ARC-520、ARC-521和ARC-AAT——的临床开发已停止,尽管它们的初步临床试验结果颇具前景.——论文作者:张琼丹1)#,陈朝霞1)#,李芾瑶1)#,张宇1)**

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